時間的に解決された SMLM (大きな PAR シフトを伴う) により、生細胞内での動的な HA クラスターの形成と移動の視覚化が可能になりました。

Jul 23, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 12561 (2023) この記事を引用

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

単一分子の点滅特性は、単一分子局在顕微鏡法 (SMLM) にとって重要です。 通常、SMLM 技術には、まばたき周期に近い検出器の露光時間を使用して、単一分子の回折限界の明るいスポットのいくつかのフレームを記録することが含まれます。 これにより、SMLM の時間分解能の制限が数十ミリ秒に設定されます。 単一分子のかなりの部分が平均的な瞬き周期よりもはるかに短い時間スケールで光子を放出することを認識し、これらの高速放出体を捕捉するためにデータ収集を加速することを提案します。 ここでは、動的イベント（単一分子レベルとアンサンブルレベルの両方）を理解するために、sCMOS検出器を利用した短時間露光ベースのSMLM（shortSMLM）方法を提案します。 この技術は、NIH3T3 細胞 (固定細胞と生細胞の両方) が Dendra2-HA プラスミド DNA によってトランスフェクトされた A 型インフルエンザ疾患モデルで実証されています。 解析の結果、標準 SMLM と比較して、空間分解能は犠牲になりますが、時間分解能が 2.76 倍向上し、粒子分解能の PAR シフト (位置特定精度の点で) \(\sim\) 11.82 nm が得られたことがわかりました。 DNA トランスフェクションの 24 時間後のトランスフェクト細胞における動的な HA クラスター形成を視覚化しました。 空間解像度の低下によってクラスターの特性 (クラスター密度、\(\#\) 分子/クラスター、クラスターの広がりなど) が実質的に変化せず、実際に重要な特徴が維持されることに注意してください。 さらに、微速度撮影イメージングにより、生細胞内のヘマグルチニン (HA) クラスターの動的な形成と移動が明らかになります。 これは、同期された高 QE sCMOS 検出器 (短い露光時間で動作) を使用する \(short-SMLM\) が、細胞システムの時間的ダイナミクスを研究するのに優れていることを示唆しています。

標準的な単一分子局在顕微鏡 (SMLM) 技術 (fPALM1、STORM2、PALM3、IML-SPIM4、MINFLUX5,6、dSTORM7、SOFI8、ROSE9、SMILE10,11、POSSIBLE12、およびバリアント 13、14、15、16、17) は通常、単一分子の数千 (\(> 10^{3}\) ) の画像を使用して、単一の超解像画像を再構成します。 これは、通常のカメラの露出時間や読み出し時間よりもかなりの取得時間になります。 全体的な時間分解能を高速化するには、データ取得を高速化する必要があります。 ただし、分子の蛍光サイクル時間により、時間分解能には制限があります18。 最近では、高速点滅分子、高励起強度、暗状態、および sCMOS カメラを使用した研究はほとんどありません 19、20、21、22、23。 他の研究では、計算技術を使用して取得時間を短縮することが有望であることが示されています。 他の技術には、高速コンピューティング エンジン (FPGA-GPU および CUDA) と人工知能を組み合わせた使用が含まれており、SMLM では大きな可能性が示されています 24、25、26、27。 これらの技術は役立ちますが、光退色が起こりやすいです。 ここでは、高速点滅蛍光タンパク質 (Dendra2) を捕捉するための高度な sCMOS テクノロジーを活用した高速データ収集について説明します。 Dendra2 の点滅動作と ON/OFF 時間は、Avilov らによって詳細に研究されています 28。 高速取得技術と高速コンピューティング エンジンは強力な組み合わせであり、リアルタイムの超解像度イメージングを可能にする可能性が高くなると予想されます。

ここ数年でこの方向に大きな進歩が見られ、多くの研究グループがこの問題に取り組んできました。 独特のアプローチは、強度や他の実験パラメーターを変更せずに、フレームあたりの活性な単一分子の数を増やすことです 21,29。 ただし、この技術にはコストがかかります。大規模な活性化により単一分子の回折限界シグネチャーが重複し、個々の分子が区別できなくなり、その後複雑さが増す可能性があります。 Lin らによる最近の研究。 Alexa Fluor 647-dye19 を使用して免疫標識された微小管の画質を定量的に比較しました。 Diekmannらによる別の研究。 は、2 つの重要な要素 (つまり、位置特定精度とラベル付け効率) が SMLM 画質を決定することを示しました。 彼らは、異なる標識効率と強度で、異なる色素 (AF647、CF680、CF660C、Dy634) の画質に及ぼす速度の影響を系統的に調査しました 21。 私たちの知る限り、Dendra 2 などの光スイッチング可能なタンパク質は、高速イメージングやタイムラプス局在化顕微鏡では実証されていないため、超解像顕微鏡で使用される重要な種類のプローブとなります。 特に、光スイッチング可能なタンパク質は、目的のタンパク質とのクローニング/結合を可能にするため、生物学的プロセス（疾患の進行など 31、32、33）の研究に適しており、根底にあるメカニズムの理解に役立ちます。